Desarrollo de metodología innovadora para la determinación de 6

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Desarrollo de metodología innovadora para la determinación de 6

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 14172 (2023) Citar este artículo 3 Detalles de Altmetric Metrics La 6-tioguanina es un fármaco inmunosupresor, un análogo de la guanina, que se aplica para tratar la enfermedad aguda

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 14172 (2023) Citar este artículo

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La 6-tioguanina es un fármaco inmunosupresor, análogo de la guanina, que se utiliza para tratar la leucemia aguda y la enfermedad inflamatoria intestinal. El uso excesivo de 6-tioguanina durante el tratamiento clínico puede provocar efectos secundarios. Además, proporcionar una dosis demasiado baja resultará ineficaz. Por lo tanto, existe una necesidad crítica de un enfoque rápido, selectivo y de rutina para cuantificar la 6-tioguanina en fluidos corporales para respaldar una aplicación clínica. Se ha desarrollado un método de HPLC totalmente validado para determinar 6-tioguanina en muestras de sangre total utilizando 5-bromouracilo como estándar interno. Los nucleótidos de 6-tioguanina se liberaron de los eritrocitos mediante ácido perclórico y luego se hidrolizaron a 100 °C hasta obtener la tiopurina original, 6-tioguanina. Se determinaron los siguientes parámetros de validación del método: especificidad/selectividad, rango de linealidad (479–17.118 ng/mL, R > 0,992), límites de detección (150 ng/mL) y cuantificación (479 ng/mL), precisión (- 5,6

La 6-tioguanina (6-TG) es un análogo purínico de la guanina; más precisamente, es un derivado azufrado de la guanina1. El 6-TG pertenecía a la familia de las tiopurinas y se introdujo en 1950 como tratamiento para la leucemia. Cincuenta años después, los médicos comenzaron a usarlo para tratar la enfermedad inflamatoria intestinal, aquellos que no habían recibido azatioprina (AZA) o mercaptopurina (MP) debido a eventos adversos que limitaban la dosis o una respuesta subóptima2, 3. Sin embargo, se han expresado preocupaciones sobre el perfil de hepatotoxicidad. obstaculizado por el uso generalizado, específicamente la hiperplasia regenerativa nodular (NRH)4. El 6-TG también se utiliza en el tratamiento clínico del síndrome de inmunodeficiencia adquirida, enfermedades autoinmunes como la psoriasis y la quimioterapia para las leucemias agudas, en particular la leucemia mieloide aguda y la leucemia linfoblástica aguda5, 6. El riesgo adicional asociado con el 6-TG puede ser el desarrollo de linfoma y cáncer de piel, como se demuestra en el caso de las terapias con AZA/MP y anti-TNF7, 8. Por lo tanto, es importante verificar periódicamente el nivel de 6-TG para confirmar la dosis correcta del fármaco o, en caso de niveles anormales resultados, para ajustar la dosis. Las tiopurinas, incluida la 6-TG, tienen un efecto inmunosupresor al incorporar sus metabolitos farmacológicamente activos, los nucleótidos de 6-tioguanina (6-TGN), en los ácidos nucleicos9. En consecuencia, esto conduce a la inhibición de la proliferación de linfocitos, incluido su importante papel en la inducción de la apoptosis10. Aunque actualmente no se comprenden bien los mecanismos que causan la resistencia de las células leucémicas a la 6-tioguanina11, se ha sugerido que la reducción o ausencia de la actividad de la hipoxantina-guanina fosforribosil transferasa (HGPT) junto con la actividad alterada de la tiopurina S-metiltransferasa (TPMT) estimulan la sensibilidad y la resistencia a esta compuestos12. Además, se ha demostrado que los defectos en el sistema de reparación de desajustes del ADN estimulan la resistencia adquirida a numerosos compuestos farmacéuticos anticancerígenos, incluida la 6-tioguanina13. La medición de los niveles del metabolito 6-TG en eritrocitos ayuda a determinar la idoneidad de la dosis de AZA y puede usarse para optimizar la dosis de la terapia con antimetabolitos para lograr una mejor respuesta clínica sin inducir leucopenia14. La combinación de infliximab y tiopurinas (como 6-tioguanina) en pacientes con enfermedades inflamatorias del intestino es más eficaz que la monoterapia. Se recomienda la medición de la actividad de TPMT antes de iniciar el tratamiento de pacientes con fármacos tiopurínicos como la 6-tioguanina, lo que permite ajustar la dosis de tiopurina o evitar por completo el fármaco15. En muchas etnias, los polimorfismos de TPMT dan como resultado una actividad de TPMT disminuida (prevalencia del 10%) o ausente (0,3%)16. Los individuos que son homocigotos o heterocigotos para estos tipos de variación genética pueden tener niveles elevados de metabolitos de TGN, lo que aumenta el riesgo de toxicidad en la médula ósea inducida por el fármaco debido a la acumulación del fármaco no metabolizado17. Los niveles de 6-TGN superiores a 230 pmol/8 × 108 glóbulos rojos se han asociado con mejores resultados en pacientes en monoterapia. Un nivel de 6-tioguanina de 125 pmol/8 × 108 glóbulos rojos o más puede ser adecuado para alcanzar niveles terapéuticos de infliximab18. Generalmente, se recomiendan niveles de 6-TGN superiores a 235 pmol/8 × 108 glóbulos rojos como nivel de corte terapéutico para pacientes que toman AZA o 6-MP19. Un nivel seguro y terapéutico está entre 500 y 800 pmol/8 × 108 glóbulos rojos20. Para la terapia con 6-TG en pacientes con EII, aún no se han descrito niveles terapéuticos o tóxicos precisos de 6-TGN. Sin embargo, la hepatotoxicidad, en particular la hiperplasia regenerativa nodular (NRH) y la enfermedad venooclusiva (EVO), depende de la dosis y está relacionada con niveles de 6-TGN superiores a 1000 pmol/8 × 108 glóbulos rojos21. El uso excesivo de 6-TG durante el tratamiento clínico puede tener efectos secundarios extratóxicos6. Además, una dosis insuficiente será ineficaz. Por lo tanto, un enfoque rápido y totalmente validado para determinar cuantitativamente 6-TG en fluidos corporales es fundamental para ayudar en el uso clínico. Actualmente, los inmunoensayos y la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) son técnicas generalizadas, prácticas y sensibles en el seguimiento de fármacos terapéuticos22, 23.

Hasta ahora, se han descrito varios enfoques analíticos para determinar los metabolitos de tiopurina aplicando UPLC-MS/MS24 y LC-MS/MS25,26,27. Los métodos definidos varían en cuanto a la matriz biológica, el procedimiento de preparación de muestras y la forma química de los analitos. Sin embargo, ninguno de los 6-TG permitidos anteriormente se puede cuantificar directamente a partir de glóbulos rojos mediante HPLC únicamente. Numerosos laboratorios de todo el mundo observan los metabolitos de la tiopurina para personalizar el tratamiento. Actualmente, el 6-TG se mide en los glóbulos rojos11 y en la sangre completa28. Los niveles de 6-TG en leucocitos oscilaron entre 100 y 2305 pmol/mg de ADN, mientras que los niveles de 6-TG en eritrocitos oscilaron entre 64 y 1038 pmol/8 × 10(8) glóbulos rojos; Los niveles de 6T-G en el ADN de los leucocitos se correlacionaron directamente con los niveles de 6-TG en los eritrocitos29. La mayoría de los efectos de la tiopurina, como la incorporación de ADN y la inmunosupresión, ocurren en los glóbulos blancos y no en los glóbulos rojos. Sin embargo, estas células existen en abundancia y se separan sin esfuerzo, lo que las convierte en una matriz alternativa racional30.

El objetivo de nuestro trabajo fue desarrollar un método HPLC totalmente validado para la determinación cuantitativa rápida y selectiva de 6-TG en eritrocitos de sangre total con fines de diagnóstico. El método ha sido rigurosamente validado. Además, se han determinado parámetros de validación específicos y una evaluación clínica que ha demostrado que el método se adapta a la determinación rutinaria de 6-TG en pacientes. Nuestro objetivo era, en primer lugar, desarrollar un método de rutina para que cualquier laboratorio pudiera repetir todo el procedimiento para estudios clínicos. Hasta donde sabemos, este artículo es el único método de HPLC simple, económico, sensible, bien caracterizado, sólido y completamente validado para monitorear 6-TG en sangre total.

Se desarrolló el método HPLC para la determinación de 6-tioguanina (6-TG) en muestras de sangre completa que contienen glóbulos rojos (RBC) utilizando 5-bromouracilo (5-BU) como estándar interno (IS). Se usó una fase móvil que consistía en ACN/tampón KH2PO4 (3/97, v/v) con 50 µl de H3PO4 en flujo isocrático. Se detectó 6-TG a una longitud de onda de 341 nm y 6-BU a 280 nm. En las condiciones cromatográficas, tanto los compuestos como el fondo biológico estaban bien separados. Para preparar las muestras se utilizó un método simple y rápido para liberar nucleótidos de 6-tioguanina de los eritrocitos mediante ácido perclórico y luego hidrolizarlos (100 °C) a la tiopurina original (6-TG) y luego hidrolizarlos (100 °C) a la tiopurina original (6-TG). tiopurina (6-TG). Al convertir el contenido de 6-TG liberado en 6-TGN, se puede determinar la cantidad de 6-TGN presente en los eritrocitos. El método ha sido completamente validado de acuerdo con EMA22, ICH23 e ISO 1702524. Dichos parámetros analíticos se describen como especificidad, selectividad, rango de linealidad, recuperación de extracción y repetibilidad, precisión (precisión intradiaria e intradiaria), exactitud, LOD y LOQ. .

El método resultó ser específico en las condiciones experimentales supuestas. Una comparación del cromatograma de la muestra de la solución acuosa del estándar de 6-tioguanina y el estándar interno (Fig. 1) muestra la ausencia de picos de sustancias que se eluyen, respectivamente, durante la retención del estándar interno y la retención de los estándares de analitos. De manera similar, una comparación del cromatograma que muestra la separación de la muestra sin analitos y el IS (Fig. 2) revela la ausencia de picos de sustancia que podrían afectar negativamente el resultado de la determinación de la sustancia problema.

Cromatogramas de una solución acuosa de 6-TG e IS.

Cromatogramas de una muestra desprovista de 6-TG e IS.

El espectro de 6-TG y el estándar interno tomados en muestras que contienen glóbulos rojos se muestran en la Fig. 3, respectivamente. La pureza de los picos de la sustancia en las muestras fortificadas con 6-TG e IS se analizó con base en el espectro de absorción de los compuestos probados y el estándar interno. Los resultados de esta serie de pruebas se muestran en la Fig. 4. El índice de pureza máximo obtenido (PPI, expresado en [%]) para 6-TG es 99,9% y para el estándar interno, 99,9%. Los valores de PPI (criterio: PPI > 95%) demuestran la alta especificidad del método.

Espectros estándar: (a) 6-tioguanina en la muestra de prueba a 2000 ng/ml, (b) estándar interno en suero.

Pureza espectral del pico: (a) 6-tioguanina a 2000 ng/ml, (b) estándar interno (media de pureza del pico 0,999, pico puro).

En conclusión, la falta de picos de sustancias que eluyen en y alrededor de los tiempos de retención de las sustancias de prueba (6-TG) y el estándar interno (6-BU) en los excipientes demuestra la especificidad precisa de la determinación de ambos compuestos de prueba. La validez de esta conclusión se ve confirmada por los datos presentados en la sección sobre la verificación de la selectividad del método y el análisis de la proporción de señales obtenidas durante la retención de analitos y el estándar interno en las muestras en blanco de varias muestras con respecto a las que caracterizan el Muestra fortificada con 6-TG al nivel LLOQ (límite inferior de cuantificación).

Según las directrices, la ausencia de sustancias interferentes se determina comparando las señales obtenidas durante el tiempo de retención del analito y el estándar interno para la muestra en blanco y la muestra en el nivel LLOQ (Figs. 5, 6). La respuesta del detector durante la retención del analito para la muestra en blanco debe ser inferior al 20 % de la señal encontrada en la muestra LLOQ y menos del 5 % de la señal durante la retención IS. En este caso, es 0% para 6-TG y 0% para IS, respectivamente. Por tanto, el procedimiento validado tiene buena selectividad. Además, el análisis de los picos de los tiempos de retención de las sustancias que interfieren en todas las muestras en blanco analizadas confirma un alto grado de picos de su separación de los picos tanto de los analitos como del IS (resolución RS > 2). Se cumplió el criterio de aceptabilidad.

Cromatogramas de una muestra en blanco.

Cromatogramas de muestras de eritrocitos fortificadas con 6-TG en el control de nivel bajo.

El análisis de la linealidad del método cromatográfico de 6-tioguanina se llevó a cabo en sangre enriquecida con sustancias de prueba en el rango que cubre el nivel terapéutico de concentración de 6-TG (100–450 pmol/8 × 108 glóbulos rojos). Sin embargo, los niveles de 6-tioguanina varían ampliamente y el rango del método se ha ampliado y validado de 479 a 17 118 ng/ml (48 pmol/8 × 108 eritrocitos y 1650 pmol/8 × 108 eritrocitos, respectivamente). Para este propósito, se analizaron una serie de soluciones de calibración de trabajo a partir del estándar 6-TG a una concentración de 10 mg/mL con la adición de una cantidad exactamente conocida e igual del estándar interno (estándar IS en una solución de 100 µg/mL). ml). Se prepararon cuatro soluciones de calibración de forma independiente para cada nivel de concentración y se dosificaron en el sistema cromatográfico. Para verificar la precisión del cálculo de la concentración de 6-TG basado en las ecuaciones de las curvas de calibración (calculadas en base a los valores promedio de las áreas superficiales de 6-TG y estándar interno), los resultados se resumen en la Tabla 1. Para facilitar Para la comparación, se presentan las concentraciones “experimentales” de las soluciones de calibración utilizadas para la calibración para los sistemas cromatográficos (C6-TGEXP y C6-TGCAL). Además, las tablas contienen diferencia de concentración (SC), sesgo de medición (Bias) y CV.

A partir de los datos presentados anteriormente, para las soluciones de calibración 1 a 6, el sesgo está en el rango de − 16,3 < sesgo < 10,1 (para 6-TG). Considerando que el criterio de aceptabilidad de las soluciones de calibración es obtener una concentración calculada a partir de la ecuación de la curva de calibración que no difiera en más del 15% de la concentración nominal (en el caso del nivel LLOQ, la concentración estimada no debe exceder el 20% de la concentración nominal), los resultados obtenidos confirman el cumplimiento del criterio de aceptabilidad del compuesto ensayado.

Según las relaciones matemáticas mencionadas en la sección Materiales y métodos, los valores LOD (Fig. 7) y LOQ (Fig. 8) para 6-TG fueron 371 ng/mL y 1123 ng/mL, respectivamente. Sin embargo, después de obtener los resultados del cálculo, se comprobó que la EP s/n (relación señal-ruido) para las concentraciones de 371 ng/ml y 1123 ng/ml, respectivamente, son mucho más altas que los requisitos supuestos; se decidió buscar una concentración que cumpliera con estos requisitos. LOD de 150 ng/ml (equivalente a 14 pmol/8*108 eritrocitos) y EP s/n = 8 y LOQ de 479 ng/ml (equivalente a 46 pmol/8*108 eritrocitos) donde EP s/n = 21. Los resultados confirman el cumplimiento del criterio de aceptabilidad del compuesto probado.

Cromatogramas de la solución de calibración (LOD) de 6-TG (150 ng/ml) (7,6 min—6-TG; 10,0 min—IS).

Cromatogramas de la solución de calibración (LOQ) de 6-TG (479 ng/mL).

La precisión del análisis de 6-TG se evaluó mediante análisis por triplicado de cinco muestras de sangre completa diferentes enriquecidas con la sustancia de prueba en tres niveles de concentración que cubrían el rango de concentración calibrado, es decir, 750 ng/ml; 4389 ng/ml, 12 540 ng/ml (equivalente a 73 pmol/8*108 eritrocitos; 423 pmol/8*108 eritrocitos, 1209 pmol/8*108 eritrocitos). El sesgo para 6-TG está en el rango de − 5,6 < sesgo < 14,7. Esto significa que el valor medio de los resultados no difirió de los valores nominales en > 15%. No existe diferencia estadística entre las concentraciones medias de los resultados calculados para el nivel de concentración y el valor de concentración conocido. Se cumplió el criterio de aceptabilidad para ambos compuestos.

Con base en las relaciones determinadas entre el área del pico de 6-TG y el estándar interno y la ecuación de las curvas de calibración, se obtuvieron concentraciones de analitos, cuyos valores medios se resumen en la Tabla 2, junto con el procesamiento estadístico de los resultados obtenidos. . El análisis de los resultados de las tablas anteriores muestra que la repetibilidad del análisis de 6-TG en tres niveles de concentraciones de analito (750 ng/ml, 4389 ng/ml y 12 450 ng/ml) expresada por el valor del coeficiente de variación (CV) está en el rango de 1,30 a 3,24%. Por tanto, se cumple el criterio de aceptación.

La precisión intermedia del análisis de 6-TG en sangre total en tres niveles de concentración expresados como coeficiente de variación (CV) está en el rango de 4,19 a 5,78% para 6-TG. La investigación fue realizada por diferentes analistas utilizando diferentes soluciones de trabajo estándar, y los resultados se presentan en la Tabla 3. Los valores obtenidos para el coeficiente de variación cumplen con el criterio de aceptabilidad.

Las áreas de superficie de los analitos y el estándar interno obtenidos para cinco muestras de sangre con EDTA diferentes enriquecidas con 6-TG e IS en tres niveles de concentración (750 ng/ml; 4389 ng/ml, 12 540 ng/ml) se presentan junto con las recuperaciones calculadas. para cada nivel en la Tabla 4.

La comparación de los valores promedio de recuperación de 6-TG e IS obtenidos a niveles de concentración individuales de ambos analitos muestra que para todos los compuestos, es comparable e independiente de la concentración del analito. La recuperación promedio de 6-TG calculada para tres niveles de concentración de este compuesto es de 79,1 a 103,6%, respectivamente. Se cumplió el criterio de aceptabilidad.

Las señales leídas durante el tiempo de retención del analito y la IS en la muestra en blanco dosificada después de que se recogieran la solución de calibración al nivel de concentración más alto. El análisis de los resultados reveló la falta de picos en el cromatograma correspondiente a la muestra en blanco. La solución de calibración con la mayor concentración de analito se dosificó inmediatamente después de la dosificación. Acredita la ausencia de transferencia de muestra, lo que confirma que se cumple el criterio de aceptación.

Las soluciones madre se han mantenido estables durante 30 días. Estándar para calibración y control: se usaron muestras de sangre completa enriquecidas con 6-TG en niveles de IS bajos (650 ng/ml) y altos (8906 ng/ml) para controles de estabilidad y se almacenaron durante 24 h en un muestreador automático a 5 °C. La elección de utilizar concentraciones de 650 ng/ml y 8906 ng/ml para la evaluación de la estabilidad se basó en varias consideraciones. En primer lugar, estas concentraciones caen dentro del rango lineal del método analítico utilizado para la evaluación. Es esencial evaluar la estabilidad en concentraciones dentro de este rango para garantizar resultados precisos y confiables durante los análisis de rutina. En segundo lugar, la decisión de evaluar la estabilidad a estas concentraciones específicas estuvo influenciada por la observación de dichas concentraciones en muestras de varios pacientes. En la práctica clínica, no es raro encontrar una gama diversa de concentraciones de analitos en muestras de pacientes. Por lo tanto, evaluar la estabilidad en concentraciones que se encuentran comúnmente en muestras del mundo real proporciona información valiosa sobre el rendimiento del ensayo en condiciones realistas. La respuesta del detector obtenida para los picos de 6-TG e IS se comparó en la muestra expuesta al parámetro verificado. Se adoptó la recuperación [%] como criterio de aceptación para las soluciones probadas con respecto a la solución recién preparada en el rango indicado anteriormente en las pruebas de recuperación. Los resultados se presentan en la Tabla 5 como el valor de las muestras preparadas de forma independiente. El análisis de los datos presentados muestra que: (a) las muestras del patrón interno, así como las muestras de patrones básicos y de trabajo, no deben congelarse; en las muestras analizadas se observaron sustancias precipitadas que no se disolvieron después de dejarlas a temperatura ambiente, así como después de usar vórtex; y (b) la muestra de sangre completa enriquecida con niveles bajos y altos de EDTA es muy estable. Almacenado en un alimentador de muestreador automático (5 °C), es estable hasta por 24 h. En conclusión, las muestras de sangre total fortificadas con dos niveles de concentración de 6-TG son estables hasta por 24 h a 5 °C. Las muestras de los pacientes se analizaron durante 10 días, realizándose pruebas diarias (las muestras se almacenaron a temperatura ambiente, en el refrigerador, y congelados). El análisis reveló que las muestras no se podían congelar (recuperación inferior al 50%). Las muestras almacenadas a temperatura ambiente durante 2 días se recuperaron por encima del 50 % (para muestras almacenadas durante más de 2 días). Las muestras almacenadas durante 7 días en el frigorífico mostraron una recuperación adecuada. Se evaluó la estabilidad de los estándares de investigación (30 días - congelador) y la estabilidad de las muestras de prueba preparadas para el análisis dentro de las 24 h. El estudio permitió determinar la estabilidad de la muestra analizada (7 días a temperatura ambiente).

Antes de desarrollar el método descrito en este artículo para la determinación rápida y sensible de 6-TG en glóbulos rojos, probamos muchos protocolos de investigación en artículos científicos sobre preparación de muestras, conocimiento de la estabilidad de las muestras y métodos analíticos. Se utilizaron métodos modificados y validados de todos estos artículos, adaptando y ampliando nuestro enfoque. Estos estudios nos inspiraron y nos brindaron una imagen amplia de la optimización del método.

El método analítico desarrollado es más rápido en comparación con el contenido en el trabajo de Cangemi et al.31 El tiempo total de la prueba toma alrededor de 40 min y permite el uso de un menor volumen de muestra inyectado en la columna cromatográfica, que a su vez puede extenderse la vida útil de la columna, lo que resulta en ahorros durante el mantenimiento de rutina.

En comparación con la publicación de Franzin et al.32, nuestro método permite una gama más amplia de muestras analizadas, límites de detección (LOD) y cuantificación (LOQ) más bajos, así como la capacidad de determinar 6-TG con una resolución superior a 2.0.

Stefan et al.33 se centraron en diferentes aspectos de la estabilidad de la muestra y el rango de referencia en varios grupos de estudio; Nuestro enfoque minimizó la cantidad de productos químicos utilizados en las muestras de prueba e impulsó esfuerzos para reducir los volúmenes de muestras. Este era un objetivo importante, especialmente para las muestras de niños que recibieron los medicamentos adecuados. Suponiendo el uso de 200 µL en nuestro estudio, es posible tomar una pequeña muestra de pacientes pequeños.

Hoy en día, donde la posibilidad de realizar análisis simples y relativamente rápidos juega un papel importante, especialmente cuando las concentraciones de fármacos se encuentran en un grupo grande de pacientes, es crucial que se estén realizando trabajos de validación para reducir aún más el volumen de muestra requerido.

La investigación tuvo como objetivo desarrollar y validar una metodología basada en HPLC rápida y sensible para determinar 6-TG en glóbulos rojos. El límite inferior de cuantificación (LLOQ) fue de 450 ng/ml y el límite superior de cuantificación (ULOQ) fue de 17 000 ng/ml de 6-TG en sangre total. Los valores LOD y LOQ calculados fueron 150 y 479 ng/ml de sangre completa, respectivamente. La curva de calibración fue lineal (R > 0,99) en el rango de concentración de 6-TG de 479 a 17.118 ng/ml en sangre completa. La precisión intradía e interdía estuvo dentro de los criterios generalmente aceptados para un método bioanalítico (<15%).

La metodología ayuda a evaluar la calidad de la terapia determinando la concentración de 6-tioguanina. El método considera el nivel de glóbulos rojos (RBC) de cada paciente en el resultado final de la muestra de prueba. Los niveles de metabolitos pueden variar significativamente. Los resultados señalan que en ocasiones se mantienen bajas concentraciones de 6-tioguanina durante mucho tiempo durante el tratamiento con este fármaco. El método permite la determinación de una amplia gama de concentraciones, lo que resulta en una gran diversidad y notables posibilidades de este método.

El método desarrollado es simple, rápido, efectivo y confiable. Es adecuado para analizar este fármaco antileucémico en un amplio rango de concentraciones terapéuticas en sangre total. Su utilidad ha sido demostrada aplicándolo al análisis de muestras de sangre reales enriquecidas con 6-TG. Por lo tanto, el método propuesto es adecuado para determinar 6-TG en sangre total para el control del nivel de fármaco y estudios farmacocinéticos.

Sigma-Aldrich suministró el 5-bromouracilo (5-BU), utilizado como estándar interno (IS), (LOTE 852473, 98 % de pureza). La 6-tioguanina (6-TG), como solución madre, fue suministrada por LGC Standards (LOTE MM0865.0, 99% de pureza). El acetonitrilo (ACN) y el ácido ortofosfórico al 85 %, ambos de calidad HPLC, se adquirieron de VWR (LOTE 83640 y 15315). El ácido perclórico (70%) se adquirió de Merck (LOTE 30755-M). Se utilizó agua desionizada de Milli-Q (Millipore) (LOTE 83645). Se utilizaron glóbulos rojos (RBC) para validar el método. Se estudiaron muestras de sangre entera tomadas de pacientes a los que se les administró 6-tioguanina en el marco de exámenes de seguimiento de drogas de rutina.

Una solución madre de 6-TG (Cp 6-TG) a una concentración de 6 mg/ml en NaOH 0,1 M. Para preparar una solución de trabajo de 6-TG (Cr 6-TG), se realizaron diluciones apropiadas en el rango de linealidad de 50 ng/ml a 2000 ng/ml. Se utilizó agua como disolvente de dilución. Un estándar interno de 5-bromouracilo (Cr IS) a una concentración de 1 mg/ml en 5 ml de NaOH 0,1 M. Los estándares y estándares internos se almacenaron a 2–8 °C.

Se extrajo sangre completa de voluntarios sanos y se recogió en tubos que contenían heparina sódica; se prefirieron las venas cubital o cefálica para el muestreo de sangre. Para 1 ml de sangre total, se añadió 1 ml de solución salina y luego se centrifugó a 5000 rpm durante 5 a 10 minutos a 4 °C; el plasma resultante se descartó. Se prestó especial atención a no alterar la capa de glóbulos blancos situada encima de los eritrocitos. La centrifugación se repitió dos veces para eliminar el plasma y dejar sólo glóbulos rojos.

Se obtuvo una serie de soluciones de calibración de trabajo a partir del estándar de 6-tioguanina a una concentración de 0,05 mg/ml (Cr 6-TG) con la adición de una cantidad exactamente conocida e igual del estándar interno (concentración del estándar IS en una solución de 1 mg/ml) y glóbulos rojos sin sustancias de estudio ni patrón interno. Los glóbulos rojos agregados a la calibración sirven como plantilla para replicar mejor las condiciones de las muestras de sangre. Esto afecta la solubilidad y la interacción del análisis con otros componentes sanguíneos, lo cual es esencial para calibrar el método analítico. En este caso, se añadieron glóbulos rojos como elemento de la matriz para adaptar las muestras a condiciones de laboratorio más realistas. Las relaciones de volumen utilizadas para preparar las soluciones de calibración de trabajo se resumen en la Tabla 6.

Las muestras de control se prepararon en sangre completa que no contenía sustancias de estudio ni estándar interno mediante fortificación con soluciones estándar de 6-TG a una concentración de 0,05 ng/ml (Cr 6-TG) con la adición de una cantidad igual y exactamente conocida del estándar interno. concentración (concentración del estándar IS en una solución de 1 mg/mL). Las relaciones de volumen utilizadas para preparar las muestras de control se resumen en la Tabla 7.

Pipetee exactamente 200 µl de sangre completa, 140 µl de solución salina (para muestras de calibración y control, agregue la cantidad adecuada de solución de trabajo y una cantidad correspondientemente menor de solución salina), 10 µl de solución estándar interna (Cr IS), 25 µl de DTT (ditrietiol: solución 1,1 M) y 50 µl de ácido perclórico (65%) en un tubo eppendorf. El contenido del tubo se mezcló completamente usando un vórtex (30 s) y se centrifugó (12.500 rpm, 10 min). Luego se transfirió el sobrenadante a Eppendorf y se calentó a 100 °C durante 40 min. Pasado este tiempo, la muestra se enfrió y se transfirió a la placa de HPLC. El contenido del vial se mezcló completamente usando un agitador (10 s) y luego se colocó en un vial del alimentador del muestreador automático. Imprescindible para garantizar que el líquido del inserto no contenga burbujas de aire.

Todos los análisis se realizaron en el modelo de sistema de cromatografía líquida Nexera X2 (Shimadzu, Japón), equipado con un muestreador automático SIL-30ACXR, una bomba LC-30 AD y un desgasificador DGU-20A5R, un horno modelo CTO-20AC y un fotodiodo modelo SPD30A. detector de matriz (PDA). Los datos fueron adquiridos y procesados con el software LabSolutions.

Las separaciones se llevaron a cabo utilizando una columna analítica Luna™, Phenomenex (250 x 4,6 mm, 5 μm). Se usó una fase móvil que constaba de 6,8 g de ACN/tampón KH2PO4 en 1 litro de 3/97 % v/v con la adición de 50 ul de H3PO4 a un caudal constante de 1,0 ml/min. La fase estacionaria fue acetonitrilo. La columna se mantuvo a longitudes de onda de 30 °C y los eluyentes se controlaron a 280 nm (análisis de 5-BU) y 341 nm (análisis de 6-TG). El volumen de inyección fue de 50 µl.

La validación del método se realizó bajo las directrices EMA34, ICH35 e ISO 1702536 en selectividad/especificidad, rango de linealidad, límites de detección y cuantificación, exactitud, precisión, recuperación de extracción, arrastre y estabilidad.

Un método analítico particular/específico debería permitir la resolución y detección del fármaco de interés y el estándar interno en la aparición de posibles fármacos coadministrados y compuestos endógenos coeluyentes en la matriz37.

La especificidad de la determinación del método de la 6-tioguanina se evaluó analizando muestras de suero sin sustancia problema ni patrón interno (prueba negativa) y la resolución entre los picos de soluciones acuosas de estándares de sustancia problema (prueba positiva) y soluciones acuosas del método interno. estándar (prueba positiva), así como entre estos picos y muestras de sangre completa con la adición de sustancias de prueba (muestras enriquecidas con 6-tioguanina) y muestras de suero enriquecidas con un estándar interno.

Se analizaron cinco muestras en blanco de diferentes pacientes para verificar la selectividad del método. En cada cromatograma, las señales obtenidas durante el tiempo de retención de 6-TG e IS se integraron y compararon con las obtenidas en la muestra enriquecida con el nivel de sustancia problema en el LLOQ (límite inferior de cuantificación).

La linealidad de un método analítico significa la respuesta proporcional directa de los resultados obtenidos a las concentraciones del analito en un conjunto de calibración apropiado. El estudio de linealidad del método cromatográfico de 6-tioguanina se llevó a cabo en sangre enriquecida con sustancias de prueba en el rango que cubre el nivel terapéutico de concentración de 6-TG (100–450 pmol/8 × 108 eritrocitos), de acuerdo con las directrices del CLSI38. Sin embargo, los niveles de 6-tioguanina variaron significativamente y el rango del método se amplió y validó de 479 a 17 118 ng/ml (48 pmol/8 × 108 eritrocitos y 1650 pmol/8 × 108 eritrocitos, respectivamente). Al convertir el rango de concentración en pmol/8 × 108 glóbulos rojos a ng/ml, se debe considerar la masa molar de 6-tioguanina. Convierta pmol a ng: divida el rango de concentración en pmol/8 × 108 RBC por el número de glóbulos rojos (8 × 108) para obtener la concentración en pmol/RBC. Luego se multiplicó la concentración en pmol/RBC por la masa molar de 6-tioguanina para convertirla en ng/RBC. Convertir ng/RBC a ng/mL: la concentración en ng/RBC se dividió por el volumen de sangre (mL) utilizado para el análisis y los resultados se ajustaron al recuento de glóbulos rojos (RBC) del paciente.

Para ello, se utiliza una serie de soluciones de calibración de trabajo obtenidas del estándar 6-TG a una concentración de 10 mg/mL con la adición de una cantidad exactamente conocida e igual de un estándar interno (concentración del estándar IS en una solución de 100 µg/mL) fue analizado. Se prepararon independientemente cuatro soluciones de calibración para cada nivel de concentración y se dosificaron en el sistema cromatográfico. El rango mínimo debe cubrir concentraciones de analitos desde 50 (LLOQ, límite inferior de cuantificación) hasta 150% (ULOQ, límite superior de cuantificación).

Los límites de detección (LOD) se determinaron con base en la siguiente relación matemática: LOD = (3,3 × DE)/a. Por otro lado, para la cuantificación (LOQ), quedó de la siguiente manera: LOQ = (10 × SD)/a. SD representa la desviación estándar de la línea de regresión y a es el coeficiente direccional de una curva de calibración.

La precisión de un método analítico (sesgo) es la cercanía de los resultados promedio obtenidos por un método determinado a la concentración real del analito en la muestra. Se determina basándose en análisis de muestras que contienen concentraciones exactamente conocidas del analito y análisis de las llamadas muestras de control. Los factores que afectan la precisión de un método determinado son los componentes de los errores tanto sistemáticos como aleatorios. La veracidad, el grado de concordancia entre el valor tradicional y la media experimental, se mide como una desviación porcentual del valor de referencia aceptado (Sesgo)37. Para la evaluación estadística se utilizó la prueba t de Student. Criterio de aceptación para muestras biológicas: el valor medio de los resultados no debe desviarse del valor nominal en más del 15% (20% para LLOQ).

La precisión es el grado de dispersión entre mediciones de una serie de muestras múltiples de la misma muestra homogénea en las mismas condiciones experimentales. Generalmente se expresa como inexactitud y se informa como desviación estándar relativa (RSD, CV). La precisión puede ser repetibilidad o precisión intermedia. El artículo define repetibilidad y precisión intermedia.

Repetibilidad significa precisión en condiciones operativas específicas durante un período corto (generalmente dentro de un día después del análisis). Para determinar la reproducibilidad del método, se utilizaron muestras de sangre completa enriquecidas con diversas cantidades de 6-TG que contenían concentraciones conocidas con precisión de ambos compuestos y el estándar interno. Para ello, se fortificaron cinco muestras de control de sangre completa que no contenían la sustancia de prueba con 6-TG en tres niveles de concentración (750 ng/ml, 4389 ng/ml y 12 450 ng/ml) y se sometieron a análisis cromatográfico triple.

Se realizaron estudios de precisión intermedia durante 2 días en 5 muestras diferentes de sangre total, que, como antes, se enriquecieron en tres niveles de concentración, incluidos niveles bajo, medio y alto de 6-TG en sangre total, y se sometieron a un análisis cromatográfico triple. . Los análisis fueron realizados por diferentes analistas utilizando diferentes soluciones estándar. La precisión intermedia del análisis de 6-TG en sangre total en tres niveles de concentración se expresa mediante el coeficiente de variación (CV).

La recuperación de la extracción se determinó como el porcentaje de la reacción del analito después de la preparación de la muestra en comparación con la respuesta del analito presente en la solución estándar a una concentración conocida. La recuperación de la extracción de 6-TG a partir de muestras de suero se determinó en tres niveles de concentración del analito, 750 ng/ml, 4389 ng/ml y 12 450 ng/ml, en relación con una solución acuosa de una mezcla de 6-TG e IS.

El arrastre se refiere a la contaminación de la muestra que se analiza con una sustancia presente en el circuito del muestreador automático después del análisis anterior. Estas pruebas se llevan a cabo utilizando dos soluciones de dosificación alternas. La primera es la solución de calibración con la concentración más alta de la sustancia problema y la segunda es una muestra en blanco que no contiene ni la sustancia problema ni el estándar interno. La ausencia de picos en el cromatograma de la muestra en blanco indica falta de transferencia.

Estabilidad significa la estabilidad química del analito en cada matriz bajo ciertas condiciones durante intervalos de tiempo particulares37. La estabilidad de las muestras de sangre completa fortificadas con niveles de concentración de 650 ng/ml y 8906 ng/ml de 6-TG con el estándar interno (IS) se probó, se preparó adecuadamente y se almacenó durante 24 h en el muestreador automático a 5 °C. El análisis de estabilidad comparó la respuesta del detector obtenida para los picos de 6-TG e IS en la muestra expuesta al parámetro verificado. El criterio de aceptación fue la recuperación determinada para las soluciones ensayadas respecto a la solución recién preparada en el rango indicado anteriormente en las pruebas de recuperación.

Este estudio siguió las directrices del Consejo Polaco de Agencias de Investigación Médica. Involucramos a voluntarios humanos según las directrices de la Declaración de Helsinki. Todos los participantes conocían el propósito de la investigación. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes o de sus tutores legales. La metodología ha sido desarrollada para análisis comerciales realizados en un laboratorio de diagnóstico certificado. Ni el Centro Polaco de Acreditación (PN-EN ISO 15189) ni la Cámara Nacional de Diagnósticos de Laboratorio indican la necesidad de obtener el consentimiento del comité de bioética. Generalmente, la sangre y sus fracciones y la orina son el material más común para las determinaciones de rutina en este tipo de unidades de laboratorio. La legislación polaca (Ley sobre ensayos clínicos de medicamentos para uso humano del 13/01/2023) establece que en este caso no se requiere aprobación ética.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el presente estudio están disponibles a través de los autores correspondientes previa solicitud razonable.

Petit, E. y col. Efectos tóxicos diferenciales de azatioprina, 6-mercaptopurina y 6-tioguanina en hepatocitos humanos. Toxico. In Vitro 22, 632–642 (2008).