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May 26, 2024

Multidrogas resensibilizantes

Communications Biology volumen 6, Número de artículo: 810 (2023) Citar este artículo 20 Accesos Detalles de métricas La creciente incidencia de infecciones bacterianas causadas por bacterias multirresistentes (MDR)

Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 810 (2023) Citar este artículo

20 Accesos

Detalles de métricas

La creciente incidencia de infecciones bacterianas causadas por bacterias gramnegativas multirresistentes (MDR) ha profundizado la necesidad de nuevos tratamientos eficaces. La estrategia de adyuvante con antibióticos es un enfoque más eficaz y económico para ampliar la vida útil de los antibióticos utilizados actualmente. En este documento, descubrimos que el disulfiram (DSF) y sus derivados son potentes adyuvantes antibióticos, que potencian drásticamente la actividad antibacteriana de los carbapenémicos y la colistina contra la metalo-β-lactamasa de Nueva Delhi (NDM) y la resistencia a la colistina movilizada (MCR). -que expresan patógenos Gram-negativos, respectivamente. Los estudios mecanicistas indican que DSF mejora la eficacia de meropenem al inhibir específicamente la actividad de NDM. Además, la fuerte potenciación del DSF a colistina se debe a su capacidad para exacerbar los efectos dañinos de la colistina en la membrana y alterar el metabolismo bacteriano. En particular, los ensayos de paso y conjugación revelan que DSF minimiza la evolución y propagación de la resistencia a meropenem y colistina en patógenos clínicos. Finalmente, se evaluó su eficacia sinérgica en modelos animales y la combinación DSF-colistina/meropenem podría tratar eficazmente las infecciones bacterianas MDR in vivo. En conjunto, nuestros trabajos demuestran que DSF y sus derivados son adyuvantes versátiles y potentes de colistina y carbapenémicos, lo que abre un nuevo horizonte para el tratamiento de infecciones difíciles de tratar.

Los determinantes de resistencia emergentes transmitidos por plásmidos han desafiado gravemente la eficacia clínica de los antibióticos, lo que representa una amenaza global para el sistema de salud pública1,2. Por lo tanto, para combatir las infecciones bacterianas causadas por patógenos multirresistentes (MDR), los carbapenémicos y la colistina se han considerado los antibióticos de último recurso3,4. Sin embargo, el descubrimiento y la difusión de la metalo-β-lactamasa 1 (NDM-1) de Nueva Delhi en 2009 y la movilización de las fosfoetanolamina transferasas que codifican el gen de resistencia a la colistina (mcr-1) desde 2015 perjudicaron sustancialmente la eficacia de meropenem y colistina, respectivamente5,6. . Además, casi todos los antibióticos β-lactámicos disponibles pierden eficacia debido a la NDM-1 y otras metalo-β-lactamasas (MBL). Mientras tanto, el gen mcr-1 de resistencia a la colistina móvil transmitido por plásmidos y sus variantes, mcr-2 a mcr-10, ya se han diseminado en más de 40 países/regiones y han provocado un mecanismo transferible de resistencia a la colistina7. Además, el descubrimiento y desarrollo de nuevos antibióticos eficaces se ha estancado, exacerbando la crisis de resistencia a los medicamentos8. Para maximizar la eficacia de los antibióticos y minimizar sus efectos secundarios y el desarrollo de resistencias, se ha recomendado la terapia combinada como una alternativa más segura y económica9. Por ejemplo, la colistina mostró actividad sinérgica dependiente del tiempo contra Acinetobacter baumannii multirresistente (MDR) en combinación con aztreonam10, y destrucción sinérgica de patógenos gramnegativos MDR con rifampicina11,12,13. Sin embargo, la combinación de antibióticos con otros antibióticos puede provocar la aparición de cepas bacterianas MDR. Por el contrario, la combinación de compuestos antibióticos y no antibióticos, generalmente también denominados adyuvantes antibióticos14, puede evitar este defecto al tiempo que resensibiliza las bacterias resistentes a los antibióticos clínicamente importantes9.

El disulfiram (DSF), un medicamento oral recetado, se conoce como fármaco antialcoholismo para el tratamiento del alcoholismo crónico15. Según estudios farmacocinéticos, los subproductos del metabolismo del DSF, como el dietilditiocarbamato (DDTC) y la dietilamina, acumulan acetaldehído tóxico durante la conversión del etanol en ácido acético y funcionan como inhibidores de la aldehído deshidrogenasa16. Además, también se han demostrado parcialmente otras funciones farmacológicas del DSF, como los efectos profilácticos y terapéuticos sobre la obesidad inducida por la dieta17 y los efectos supresores de tumores18. Además, varios estudios han investigado la actividad antibacteriana directa del DSF y sus metabolitos16. Por ejemplo, un estudio previo demostró que el DSF tenía actividad antibacteriana equipotente contra Staphylococcus aureus con concentraciones inhibidoras mínimas (CMI) de 8 a 16 mg/l, y erradicaba las biopelículas de estafilococos, así como el S. aureus intracelular19. También se descubrió que el DSF previene el crecimiento in vitro del oomiceto Pythium insidiosum al inhibir la actividad de la ureasa bacteriana y la aldehído deshidrogenasa20. Sin embargo, todavía no se comprende bien la potenciación del DSF y sus metabolitos frente a los antibióticos existentes, en particular los carbapenémicos y la colistina.

En este estudio, evaluamos exhaustivamente la potencia del DSF y sus derivados como posibles adyuvantes antibióticos para restaurar la eficacia de antibióticos clínicamente relevantes. Aquí, descubrimos que DSF y sus derivados mejoran efectivamente la eficacia de meropenem y colistina tanto in vivo como in vitro, al tiempo que inhiben drásticamente la evolución y transmisión de la resistencia a los medicamentos. El descubrimiento del DSF y sus derivados como potentes potenciadores de los antibióticos proporciona una estrategia combinada prometedora para luchar contra los enterobacterales resistentes a los carbapenémicos y los patógenos gramnegativos resistentes a la colistina.

Para investigar la potenciación del DSF y sus derivados (Figura 1 complementaria) a los antibióticos existentes, realizamos ensayos de tablero de ajedrez para evaluar sus efectos sinérgicos en múltiples clases de antibióticos, incluidos ciprofloxacino, vancomicina, tigeciclina, doxiciclina, meropenem y colistina, contra un MDR aísla E. coli B221, que confiere resistencia a casi todas las clases principales de antibióticos. El valor del índice de concentración inhibitoria fraccional (FICI) se utilizó para evaluar la interacción farmacológica de dos compuestos (A y B) y se calculó como la suma de FICIA y FICIB. En particular, una comparación entre estos antibióticos reveló que la actividad de meropenem y colistina mejoró notablemente en presencia de DSF, con un FICI de 0,125 para ambos (Fig. 1a), lo que indica que DSF tuvo un efecto antibacteriano sinérgico con meropenem y colistina. Las CIM relativas de meropenem y colistina disminuyeron de 32 a 2 µg/ml (16 veces) y de 8 a 0,25 µg/ml (32 veces) por debajo de una cuarta parte de la CMI de DSF (Tabla complementaria 2). Además, los derivados del DSF, incluidos el dietilditiocarbamato (DDC) y el dimetilditiocarbamato (DMDC), también mostraron una potente actividad sinérgica con meropenem y colistina de todos los antibióticos probados. La sub-CMI de DDC (16 µg/mL) redujo sustancialmente sus CMI 16 veces al tiempo que revirtió la resistencia a meropenem y colistina en E. coli B2 (FICI = 0,188/0,125, respectivamente) (Fig. 1b). De manera similar, las CIM de meropenem y colistina contra E. coli B2 disminuyeron 8 y 16 veces cuando se trataron con sub-CIM de DMDC (8 µg/mL) (FICI = 0,25/0,25, respectivamente) (Fig. 1c y Tabla complementaria 3). Para validar la potenciación, evaluamos más a fondo estas combinaciones en varios tipos de bacterias Gram negativas, incluidas cepas sensibles a los medicamentos, Enterobacterales productoras de MCR y Enterobacteriaceae MBL positivas. Como se demuestra en la Tabla complementaria 4, DSF, DDC y DMDC restauraron completamente la susceptibilidad de los patógenos gramnegativos NDM positivos, pero no de las bacterias NDM negativas. Estos patógenos gramnegativos NDM positivos portan el gen blaNDM-1 o blaNDM-5 y son resistentes al meropenem con CIM de 16 a 32 µg/ml. Además, encontramos que DSF y sus metabolitos (¼ MIC) mejoraron efectivamente la actividad de la colistina contra patógenos Gram negativos tanto MCR negativos como positivos entre 4 y 64 veces (Figura complementaria 2, Tabla complementaria 5), ​​incluidos los susceptibles a la colistina. bacterias y E. coli DH5α (PUC19-mcr-1), E. coli G92 (mcr-1), E. coli CP131 (mcr-3) y K. pneumoniae D120 (mcr-8) resistentes a la colistina. Vale la pena señalar que las bacterias resistentes a la colistina se potenciaron entre 2 y 16 veces más que las bacterias sensibles con DSF, DDC y DMDC en combinación con colistina, respectivamente. Estos hallazgos demuestran que el DSF y sus metabolitos son potentes carbapenémicos y adyuvantes de colistina.

El eje horizontal representa las concentraciones de DSF (a), DDC (b) y DMDC (c), y el eje vertical representa las concentraciones de seis antibióticos. Las regiones de color más oscuro indican una mayor densidad celular y las regiones más claras indican una menor densidad celular. Los datos representan la absorbancia media a 600 nm de réplicas biológicas.

Para examinar más a fondo el efecto sinérgico de DSF con meropenem, se realizaron más análisis de microdilución en caldo de tablero de ajedrez y destrucción dependiente del tiempo. De acuerdo con los resultados anteriores, DSF mejoró notablemente la actividad de meropenem contra E. coli DH5α (PUC19-blaNDM) (FICI = 0,188) en lugar de E. coli DH5α (PUC19) (FICI = 2,0) (Fig. 2a, b), lo que indica que la acción del DSF se relacionó con la inhibición de los determinantes de la resistencia. Además, se llevaron a cabo dinámicas de eliminación del tiempo en varios patógenos positivos para NDM para investigar el efecto bactericida sinérgico de meropenem más DSF. Como se muestra en la Fig. 2c, la combinación de las sub-CIM de meropenem y DSF condujo a una reducción de más de 4 log10 UFC de cuatro bacterias positivas para NDM analizadas durante 24 h. Por el contrario, concentraciones idénticas de meropenem (4 u 8 µg/ml) y DSF (64 µg/ml) por sí solas no lograron prevenir la proliferación bacteriana.

a, b Ensayos de tablero de ajedrez entre DSF y meropenem contra E. coli DH5a (PUC19) (a) y E. coli DH5a (PUC19-blaNDM-1) (b). La DO600 se midió después de 18 h de incubación a 37 °C. Los datos representan la DO600 media de réplicas biológicas. c Curvas de destrucción dependiente del tiempo bajo el tratamiento combinado de meropenem y DSF contra E. coli C3 (blaNDM-1), S. enteritidis H8 (blaNDM-1), E. coli G6 (blaNDM-5) y MDR E. coli B2 (blaNDM-5). Las cepas bacterianas se cultivaron durante 4 h en caldo MHB y luego se trataron con PBS, meropenem (sub-MIC) o DSF (64 μg/ml) solos o en combinación. Se determinaron las UFC bacterianas por ml en diferentes momentos durante 24 h. d Efecto inhibidor in vitro dependiente de la dosis de DSF sobre la actividad de NDM-1 y NDM-5. IC50, concentración inhibidora media máxima. Los datos en (c) y (d) de tres réplicas biológicas se presentaron como media ± DE. e Análisis de acoplamiento molecular de los complejos de NDM-1 con DSF. En la vista 2D de primer plano, los enlaces de hidrógeno formados entre ellos se representaron como una línea de puntos verde, y los residuos involucrados en la formación del enlace de hidrógeno son CYS208 y LYS211, donde se formó un átomo de azufre de DSF en coordinación con Zn.

Teniendo en cuenta el efecto potenciador específico del DSF sobre las bacterias positivas para NDM, planteamos la hipótesis de que el DSF restaura la susceptibilidad de las bacterias resistentes a los medicamentos al meropenem al atacar la enzima NDM. Para probar esto, evaluamos la actividad enzimática de NDM-1 y NDM-5 después de la exposición a concentraciones crecientes de DSF. Como se esperaba, DSF suprimió de forma dependiente de la dosis la actividad de NDM-1 y NDM-5, con IC50 de 32,49 µg/ml y 28,32 µg/ml, respectivamente (Fig. 2d), lo que sugiere que DSF puede actuar como un nuevo inhibidor de NDM. A continuación, se realizó un análisis de acoplamiento molecular para explorar cómo interactúa DSF con la proteína NDM para inhibir su actividad. El acoplamiento simulado por computadora, utilizando una caja de cuadrícula que rodea la estructura de bolsillo activa de NDM-1 (PDB ID: 4EYL), indicó que DSF podría encajar en el sitio activo y unirse con CYS208 y LYS211 (Fig. 2e), con la unión más baja. energía de −5,14 kcal/mol (Tabla complementaria 7). Además, el análisis de acoplamiento de los complejos de NDM-1 con DDC y DMDC demostró que los derivados de DSF también podrían unirse directamente al bolsillo activo. Como se muestra en la figura complementaria 6, DDC y DMDC también podrían unirse con LYS211, que es importante para la actividad de NDM-122,23,24, con la energía de unión más baja de −3,40 kcal/mol y −3,63 kcal/mol, respectivamente. En conjunto, nuestros resultados indican que el mecanismo subyacente por el cual DSF y sus derivados resensibilizan las bacterias positivas para NDM a meropenem es atribuible a su capacidad para unirse e inhibir la actividad de NDM.

Para evaluar más a fondo la actividad sinérgica entre DSF y colistina, también se realizaron ensayos de tablero de ajedrez en tres aislados clínicos positivos para MCR, incluidos E. coli G92 (mcr-1), E. coli CP131 (mcr-3) y K. pneumonine D120 ( mcr-8). Sorprendentemente, la combinación de DSF y colistina mostró una actividad antibacteriana sinérgica sin precedentes contra estos patógenos portadores de mcr, con valores FICI de 0,047, 0,063 y 0,047, respectivamente (Fig. 3a). Para explorar la actividad bactericida sinérgica de esta combinación, también se determinaron curvas de destrucción dependiente del tiempo para diferentes bacterias Gram-negativas MCR positivas. Los resultados revelaron que todas las bacterias resistentes a la colistina se eliminaron eficazmente de manera dependiente del tiempo bajo el tratamiento combinado de DSF y colistina (Fig. 3b), mientras que las concentraciones correspondientes de los dos compuestos por sí solas no tienen ningún efecto sobre el crecimiento bacteriano.

a Ensayos de tablero de ajedrez de DSF y colistina contra bacterias Gram-negativas positivas para MCR, relacionados con la Tabla complementaria 5. Las regiones de color azul oscuro representan una mayor densidad celular. Los datos representan el valor medio de DO a 600 nm de réplicas biológicas. b Curvas de destrucción dependiente del tiempo de bacterias mcr positivas mediante el tratamiento combinado de colistina y DSF. MDR E. coli B2 (mcr-1), E. coli G92 (mcr-1), E. coli CP131 (mcr-3) y K. pneumoniae D120 (mcr-8) se cultivaron hasta 4 h en caldo MHB. luego se trató con PBS, colistina (sub-MIC) o DSF (64 μg/ml) solos o en combinación. Se determinaron las UFC bacterianas por ml en diferentes momentos durante 24 h. Los datos de tres réplicas biológicas se presentaron como media ± DE.

Teniendo en cuenta que la formación de biopelículas afecta dramáticamente la eficacia de los antibióticos, se realizaron experimentos de formación y erradicación de biopelículas para explorar la influencia del DSF. Las biopelículas bacterianas se cultivaron en presencia de diferentes concentraciones de colistina sola o en combinación con DSF a 64 μg/ml. Como se muestra en la figura complementaria 3a, el suplemento de DSF evitó en gran medida la formación de biopelículas en comparación con la colistina sola. Además, DSF en combinación con colistina mostró un efecto erradicable significativo sobre la biopelícula madura de una manera dependiente de la dosis (Figura complementaria 3b). En conjunto, estos datos indican que el DSF potencia en gran medida la actividad de la colistina contra patógenos positivos para MCR en diferentes estados metabólicos.

Los resultados anteriores revelaron que la actividad potenciadora de DSF a colistina puede estar relacionada con el determinante de resistencia mcr, por lo que se realizó un análisis RT-qPCR para evaluar la expresión del gen mcr-1 en E. coli B2 expuesta a sub-MIC de DSF. Como se demuestra en la Fig. 4a, DSF inhibió significativamente la expresión del ARNm de mcr-1 de una manera dependiente de la dosis. Mientras tanto, los resultados del acoplamiento molecular mostraron que DSF y sus derivados podrían unirse directamente a MCR-1 (Fig. 4b, Fig. Suplementaria 7, Tabla Suplementaria 8), un miembro raro de las fosfoetanolamina transferasas del lípido A (EptA) 25. Por lo tanto, especulamos que la expresión de mcr-1 regulada negativamente y la interacción de DSF-MCR contribuyen a alterar la acción de la proteína MCR, mejorando así la interacción electrostática de la colistina y la membrana bacteriana. A continuación, se realizó un análisis de microscopía electrónica de barrido (SEM) para evaluar el daño de la membrana bacteriana bajo la combinación DSF-colistina. Descubrimos que las células de E. coli B2 en el grupo de control, así como la colistina y el DSF actuando solos, mostraban superficies regulares e intactas. Por el contrario, las células tratadas con una combinación de colistina y DSF mostraron un daño celular severo, incluidas superficies irregulares y colapsadas (Fig. 4c), lo que sugiere que los mecanismos de esta combinación estaban asociados con la ruptura de la membrana bacteriana.

una expresión de ARNm del gen mcr-1 después de la exposición a concentraciones crecientes de DSF. El análisis de los datos se realizó utilizando el método 2^-(∆∆Ct), con el ARNr 16S como gen de mantenimiento. Los datos se presentaron como media ± DE de tres réplicas biológicas y la significación estadística se analizó mediante ANOVA unidireccional (****P <0,0001). b Análisis de acoplamiento molecular de los complejos de la proteína MCR-1 con DSF. El compuesto participa en la formación de coordinación del metal con el ion zinc del sitio activo, marcado con líneas grises. c Imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM) de E. coli B2 incubadas con colistina, DSF y la combinación de ellos. Barra de cicatriz, 1 μm. d – f Permeabilidad de la membrana externa (d), potencial de membrana (e) y nivel de ROS (f) de E. coli B2 bajo diferentes concentraciones de colistina con o sin DSF (64 μg/mL), determinados mediante el monitoreo de la intensidad de fluorescencia del propidio yoduro (PI), yoduro de 3,3'-dipropiltiadicarbocianina (DiSC3(5)) y diacetato de 2',7'-diclorodihidrofluoresceína (DCFH-DA), respectivamente. Los datos se expresaron como media ± DE de tres réplicas biológicas y la significación estadística se analizó mediante ANOVA de dos vías con la prueba de comparaciones múltiples de Sidak (****P <0,0001).

A continuación, se determinó la permeabilidad de la membrana bajo exposición a colistina que oscilaba entre 0 y 16 μg/ml sola o en combinación con DSF (64 μg/ml) utilizando una sonda fluorescente 1-N-fenilnaftilamina (NPN). De acuerdo con los resultados de SEM, la permeabilidad de la membrana de E. coli B2 aumentó significativamente en el grupo de combinación en comparación con la colistina sola (Fig. 4d). Para caracterizar aún más el daño de la membrana causado por el tratamiento combinado, evaluamos el potencial de membrana y los niveles de ROS intracelulares utilizando yoduro de 3,3'-dipropiltiadicarbocianina (DiSC3 (5)) y diacetato de 2',7'-diclorodihidrofluorescei (DCFH-DA), respectivamente. . Como se presenta en la Fig. 4e, f, en comparación con el grupo de colistina, la suplementación con DSF disipó el potencial de membrana y aumentó el daño oxidativo de la colistina en E. coli B2. Estos resultados indican que DSF bloquea la función de la proteína MCR y restaura el daño de la colistina a las membranas bacterianas, volviendo así a sensibilizar a las bacterias resistentes a los medicamentos a la colistina.

Para investigar más a fondo y dilucidar el efecto de la combinación DSF-colistina en bacterias mcr positivas, realizamos un análisis de secuenciación de ARN para comparar los genes expresados ​​diferencialmente (DEG) de E. coli B2 bajo la combinación DSF-colistina (64 + 2 μg/ ml) versus colistina sola (2 μg/ml). El gráfico del volcán (Fig. 5a) mostró que se identificaron un total de 1368 DEG (667 regulados positivamente y 701 regulados negativamente) con patrones de expresión altamente significativos bajo tratamiento con colistina sin/con DSF. Sorprendentemente, el análisis de enriquecimiento de las vías KEGG no mostró una regulación positiva apreciable de las vías enriquecidas. Además, los DEG asociados con los ribosomas, la fosforilación oxidativa, el metabolismo de la pirimidina, el metabolismo de las purinas, el ciclo del citrato (ciclo del TCA) y el sistema de dos componentes se redujeron significativamente con la combinación DSF-colistina en comparación con la colistina sola (Fig. 5b). Se realizó además el ensayo RT-qPCR para validar los cambios transcripcionales inducidos por la combinación. Se examinaron cuidadosamente los genes asociados con los ribosomas, la fosforilación oxidativa y el metabolismo de las pirimidinas, y se observó una consistencia relativamente alta (Figura complementaria 4). Los genes candidatos seleccionados muestran una expresión diferencial de al menos el doble en comparación con la del grupo de colistina sola.

un gráfico de volcán de los genes de expresión diferencial (DEG) en E. coli B2 después de la exposición a colistina sola (2 μg/ml) o en combinación con DSF (64 μg/ml) durante 4 h. Los ejes xey en A representan los cambios de expresión y el grado estadísticamente significativo correspondiente, respectivamente. Un valor de P ajustado < 0,05 (prueba t de Student con ajuste de la tasa de descubrimiento falso de Benjamini-Hochberg) y |log2 Cambio en veces | Se aplicó ≥1 como límite para DEG significativos. b Análisis de enriquecimiento KEGG (Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto) de DEG regulados negativamente. Se mostraron las 10 vías más significativamente enriquecidas. c Análisis de conglomerados de DEG seleccionados implicados en ribosomas, fosforilación oxidativa, ciclo de TCA, sistema de dos componentes, metabolismo de purinas y metabolismo de pirimidinas. Los datos se presentaron como medias de tres réplicas biológicas. COL: colistina sola; COL + DSF, la combinación de colistina y DSF.

En particular, el ciclo del TCA desempeña un papel vital en la respiración celular de las bacterias y proporciona numerosos intermediarios críticos necesarios para otros procesos metabólicos vitales, incluidos el succinato y el citrato26. Sin embargo, los niveles de expresión genética de frdA, frdB, frdC, frdD que codifican la fumarato reductasa (FRD), que podría reducir el ácido fumárico a succínico, se redujeron significativamente. La citrato liasa necesaria para la fermentación del citrato por E. coli está controlada por el grupo de genes citCDEFXGT en el sistema de dos componentes CitA/CitB. Los genes que controlan la síntesis de citrato no se alteraron sustancialmente, mientras que citC en el grupo de genes se reguló marcadamente a la baja.

La fosforilación oxidativa es también una de las vías que afectan el metabolismo central bacteriano. En comparación con los tratados con colistina sola, los genes que codifican Nuo (nuoE, nuoG, nuoI, nuoK, nuoL, nuoM), la más eficiente de las cuatro NADH deshidrogenasas, fueron reprimidos significativamente por la combinación DSF-colistina, lo que sugiere un estado redox reducido. Además, la expresión de los genes de la ATP sintasa (atpB, atpD, atpE, atpG, atpH) también disminuyó. En conjunto, la inhibición de los metabolitos de carbono centrales reduce la transferencia de electrones y la síntesis de ATP, lo que hace que las bacterias sean más susceptibles a la destrucción. También observamos la inhibición del metabolismo de ribosomas y nucleótidos, correspondiente a la traducción y transcripción, respectivamente (Fig. 5c). En general, llegamos a la conclusión de que el tratamiento combinado deja a las bacterias en un estado de muerte inminente, donde se inhiben tanto los procesos centrales como el metabolismo energético, en línea con los resultados anteriores que demuestran su potente efecto bactericida.

Para obtener más información sobre si la adición de DSF contribuye a prevenir el desarrollo de resistencia a los antibióticos, llevamos a cabo ensayos de pases en serie en bacterias positivas para NDM o MCR después de la exposición a meropenem/colistina, DSF y su combinación. Nuestros resultados mostraron que la resistencia a meropenem o colistina permaneció inalterada cuando se combinaron con DSF, mientras que meropenem o colistina solos aumentaron las CIM 8 veces en 24 pases seriados, lo que indica que DSF previene la evolución de la resistencia a los medicamentos (Fig. 6a, c, Tabla complementaria 9). La concentración de prevención de mutantes (MPC) es una concentración umbral antibacteriana en la que las bacterias solo pueden crecer con dos o más de dos mutaciones, lo que limita la proliferación selectiva de cepas mutantes. El índice de prevención de mutaciones (MPI) se determinó mediante la ecuación de MPC/MIC, que representa la apertura de la ventana de selección de mutantes (MSW, rango de concentración entre MIC y MPC). Cuando los RSU son más estrechos, es menos probable que se desarrollen cepas resistentes a los medicamentos27. Como se muestra en las figuras 6a a d, en presencia de DSF, el MPI de meropenem y colistina disminuyó significativamente de 32 y 16 a 2 y 1, respectivamente, lo que sugiere que la adición de DSF hace que las bacterias tengan menos probabilidades de ser resistentes a los medicamentos. . Los datos combinados demuestran claramente que DSF restringe el desarrollo de resistencia a meropenem y colistina y el enriquecimiento de subpoblaciones mutantes.

a, c Curvas de desarrollo de resistencia durante el paso en serie de E. coli C3 positiva para NDM (a) o E. coli G92 positiva para MCR (c) en presencia de sub-CIM de meropenem/colistina o en la combinación de DSF, respectivamente . b, d Índices MPI de meropenem/colistina en presencia de concentraciones crecientes de DSF contra E. coli C3 (b) positiva para NDM o E. coli G92 positiva para MCR (d), respectivamente. e Cambio en veces de la frecuencia de transferencia conjugativa del plásmido RP4-7 de E. coli DH5α a E. coli EC600 en presencia de concentraciones crecientes de DSF. f – i Cambios en veces de la frecuencia de transferencia conjugativa de plásmidos positivos para blaNDM-5 de E. coli L65 (f) y K. pneumoniae C12 (g), plásmidos positivos para mcr-1 de E. coli LD67-1 (h) y E .coli LD93-1 (i) a E. coli EC600 bajo diferentes concentraciones de DSF. Los datos en (e – i) se expresaron como media ± DE de tres réplicas biológicas. La significación estadística se analizó mediante ANOVA unidireccional (***P <0,001, ****P <0,0001).

Como una de las principales vías de transferencia horizontal de genes (THG), la conjugación desempeña un papel esencial en la adquisición y transmisión de genes de resistencia a antibióticos (ARG)28. Por lo tanto, realizamos una serie de ensayos de conjugación para determinar el impacto de DSF en la transferencia de plásmidos de resistencia. En comparación con el control, la frecuencia de conjugación del plásmido RP4-7 se redujo significativamente bajo el tratamiento con DSF (Fig. 6e). Para investigar más a fondo el efecto de DSF en aislados clínicos, realizamos experimentos de conjugación con aislados clínicos que albergan varios tipos de plásmidos que transportan mcr-1 y blaNDM-5. Consistentemente, DSF inhibió con éxito la transmisión de plásmidos IncX3 positivos para blaNDM-5 de donantes a receptores (Fig. 6f, g). De manera similar, la transmisión de los plásmidos IncX4 pLD93-1 e IncI2 pLD67-1 que transportan mcr-1 de E. coli LD67-1 y LD93-1 a E. coli EC600 obviamente disminuyó en presencia de DSF (Fig. 6h, i ). Estos resultados indicaron el potencial de DSF para prevenir la propagación de plásmidos portadores de ARG. En conjunto, estos datos demuestran que DSF podría minimizar la evolución y propagación de la resistencia a meropenem y colistina.

Antes de la evaluación de la eficacia in vivo, realizamos una serie de experimentos de seguridad para evaluar la toxicidad de la combinación de DSF y colistina, incluida la actividad hemolítica en glóbulos rojos de mamíferos y la toxicidad in vivo en ratones. Curiosamente, el uso combinado de DSF (0 a 128 μg/mL) y colistina (2 a 16 μg/mL) mostró una tasa de hemólisis baja (<10%) (Figura complementaria 5). Además, en comparación con el grupo de vehículos, no se observó toxicidad en modelos de ratones coadministrados con colistina y DSF (Figura complementaria 8). A continuación, se llevó a cabo un panel de modelos de infección preclínicos para explorar el potencial terapéutico del tratamiento combinado para erradicar los patógenos MDR. Los resultados indicaron que la coadministración de colistina con DSF (5 + 20 mg/kg) previno en gran medida la muerte del grupo de G. mellonella infectado por E. coli mcr positivo en comparación con el grupo de monotratamiento con colistina (P = 0,0043) ( Figura 7a). Posteriormente, evaluamos la eficacia combinada en un modelo de infección del muslo de ratón neutropénico. Como se muestra en la Fig. 7b, la terapia combinada de colistina y DSF (5 + 20 mg/kg) mostró una reducción de UFC de casi 2 log10 en comparación con la monoterapia con colistina (P = 0,0087). Además, también se demostró que DSF restablece la eficacia in vivo de meropenem en dos modelos animales de infección. Posiblemente, las larvas del grupo de vehículos y las de meropenem solas murieron en 48 h. Por el contrario, las tasas de supervivencia de G. mellonella en el grupo de meropenem más DSF (10 + 20 mg/kg) aumentaron obviamente y alcanzaron una tasa de supervivencia del 75 % durante los 7 días posteriores a la infección (P = 0,0008) (Fig. 7c ). Por último, probamos la eficacia combinada en un modelo de infección por peritonitis en ratones y descubrimos que el tratamiento con meropenem-DSF obtuvo beneficios de supervivencia en comparación con el grupo de meropenem (P = 0,03) (Fig. 7d). En conjunto, estos datos demuestran que DSF restaura eficazmente la eficacia in vivo de meropenem y colistina contra infecciones bacterianas resistentes a los medicamentos.

a Tasas de supervivencia de las larvas de G. mellonella (n = 8 animales biológicamente independientes por grupo) infectadas por E. coli B2 (106 UFC). En comparación con la monoterapia con colistina (5 mg/kg), la terapia combinada de colistina y DSF (5 + 20 mg/kg) mejoró significativamente las tasas de supervivencia de G. mellonella. b Cargas bacterianas de los ratones CD-1 (n = 6 animales biológicamente independientes por grupo) infectados por E. coli B2 (105 UFC). En comparación con la colistina sola, la terapia combinada de colistina y DSF redujo las cargas bacterianas del músculo del muslo. Los valores de P se determinaron mediante la prueba U de Mann-Whitney. c Tasas de supervivencia de las larvas de G. mellonella (n = 8 animales biológicamente independientes por grupo) infectadas por E. coli C3 (106 UFC). En comparación con la monoterapia con meropenem (10 mg/kg), la terapia combinada de meropenem y DSF (10 + 20 mg/kg) mejoró significativamente las tasas de supervivencia de las larvas. d Tasas de supervivencia de los ratones CD-1 (n = 6 animales biológicamente independientes por grupo) infectados por E. coli C3 (108 UFC) y tratados con una dosis única de meropenem (10 mg/kg), DSF (20 mg/kg ), una combinación de meropenem más DSF (10 + 10 mg/kg, 10 + 20 mg/kg) o PBS mediante inyección intraperitoneal. En (a), (c) y (d), los valores de P se determinaron mediante la prueba de rango logarítmico (Mantel-Cox).

La creciente incidencia de infecciones por resistencia a los medicamentos, particularmente causadas por patógenos gramnegativos, amenaza gravemente la salud pública. Los carbapenémicos y la colistina son los últimos recursos para el tratamiento de infecciones bacterianas difíciles de tratar en la clínica. Sin embargo, la aparición de resistencia bacteriana mediada por plásmidos a estas últimas opciones no deja regímenes disponibles en entornos clínicos. En comparación con el descubrimiento de nuevos antibióticos, la estrategia de adyuvantes antibióticos se reconoce como un enfoque más rentable para abordar los patógenos MDR. Por ejem )-E. coli positiva. Sin embargo, se descubrió que estos adyuvantes antibióticos actúan principalmente sobre uno o una clase de agentes antimicrobianos. Aquí, revelamos que un fármaco DSF aprobado por la FDA y sus derivados pueden servir como adyuvantes antibióticos versátiles y potentes para superar las bacterias gramnegativas MDR. En particular, el DSF potenció drásticamente la actividad del meropenem contra una variedad de enterobacterias resistentes a carbapenems (CRE) y la actividad de la colistina contra patógenos positivos para MCR tanto in vitro como en modelos animales de infección. En particular, la potenciación de DSF a colistina fue sólida, acompañada de un FICI más bajo en comparación con otros sinergistas de colistina9. Lo más importante es que nuestro estudio también encontró que la adición de DSF impidió la evolución de la resistencia bacteriana a meropenem y colistina e inhibió la transferencia conjugativa de blaNDM y plásmidos portadores de mcr.

Con respecto a la potenciación de DSF a carbapenems, nuestros estudios mecanicistas demostraron que DSF podría inhibir específicamente la actividad de NDM, potenciando así la eficacia de meropenem. Este modo de acción explica por qué la actividad sinérgica de meropenem y DSF solo se encontró en bacterias NDM positivas, pero no en bacterias NDM negativas. De acuerdo con nuestros hallazgos, un estudio previo también indicó que DSF podría servir como un potente inhibidor de metalo-β-lactamasa al formar un enlace SS con el residuo Cys208 de NDM y oxidar su sitio tiolato de Zn (II)24. En cuanto al potente efecto sinérgico entre DSF y colistina, nuestros resultados revelaron que DSF podría inhibir simultáneamente la expresión del ARNm de mcr-1 y unirse a las enzimas MCR, restaurando así la capacidad de daño de la membrana de la colistina. Consistentemente, el tratamiento combinado de DSF y colistina exacerbó el daño de la membrana celular, aumentó la permeabilidad de la membrana y resultó en la disipación del potencial de membrana. La inhibición del metabolismo central y del metabolismo de nucleótidos mediante el tratamiento con colistina-DSF parece ser un resultado subyacente a la actividad letal sinérgica. Estudios anteriores han demostrado que la inhibición de los objetivos de los antibióticos podría dar lugar a perturbaciones metabólicas posteriores32, y la colistina puede alterar de manera diferencial los niveles de metabolitos asociados con el metabolismo central del carbono, un nuevo objetivo para los fármacos antimicrobianos10,26,33,34,35. En el presente estudio, también demostramos que la combinación colistina-DSF perturbó drásticamente las vías metabólicas centrales del carbono, incluido el ciclo del TCA y la fosforilación oxidativa.

Hoy en día, el DSF se utiliza clínicamente para el tratamiento de la dependencia del alcohol, y algunos estudios han indicado que también es un potente agente anticancerígeno36 e inhibidor de la piroptosis37. Se sugiere que DSF tiene un perfil de riesgo aceptable y hasta el momento no hay información disponible sobre el tratamiento de sobredosis de DSF. Además, nuestros resultados demostraron que las combinaciones de DSF y colistina mostraron una hemólisis insignificante en los glóbulos rojos de los mamíferos y ninguna toxicidad aguda en modelos de ratones. Sin embargo, aún se necesitan ensayos clínicos sustanciales para evaluar la eficacia clínica de esta combinación y si tiene efectos secundarios peligrosos en humanos.

En conclusión, demostramos que DSF y sus derivados restauran notablemente la susceptibilidad de las superbacterias positivas para NDM y MCR a meropenem y colistina, respectivamente. DSF actúa principalmente inhibiendo la actividad enzimática de las proteínas de resistencia. Además, el DSF ralentiza la evolución y transmisión de la resistencia a los medicamentos. Es importante destacar que el DSF combinado con meropenem o colistina combate eficazmente las infecciones bacterianas MDR in vivo, destacando su potencial terapéutico como un potenciador antibiótico prometedor.

Las cepas utilizadas en este estudio se presentaron en la Tabla complementaria 1. Las bacterias se almacenaron en caldo nutritivo suplementado con 20% de glicerol a -80 °C. A menos que se indique lo contrario, se utilizó caldo LB o agar LB para el crecimiento normal de todas las bacterias.

La determinación de las CMI de los fármacos se basó en el método de microdilución estándar según la directriz CLSI 202138. Brevemente, los compuestos se diluyeron en serie al doble con MHB. A continuación, las suspensiones de bacterias en fase logarítmica se ajustaron a 1 × 106 UFC/ml y se mezclaron con los compuestos en una placa de microlitros de 96 pocillos (Corning, NY, EE. UU.). Las placas se incubaron a 37 °C durante 24 h y los valores de MIC se detectaron como la concentración más baja de fármacos sin crecimiento bacteriano visible.

Las actividades sinérgicas de los fármacos se probaron mediante ensayos de tablero de ajedrez39. Brevemente, se dispensaron 100 µl de MHB en una placa de microlitros de 96 pocillos. La colistina y los compuestos se crearon en una matriz de 8 × 8 con ocho diluciones en serie al doble. El cultivo bacteriano se cultivó hasta la fase logarítmica y se diluyó a 1 x 106 UFC por ml. Después de 18 h de incubación a 37 °C, se midió la absorbancia de cada pocillo a 600 nm mediante un lector de microplacas (Tecan, Männedorf, Suiza). En consecuencia, se calculó el índice de concentraciones inhibidoras fraccionarias (FICI). FICI ≤ 0,5 demuestra sinergia.

El cultivo de bacterias durante la noche se diluyó 1:1000 en LB y se incubó durante 4 h a 37 °C con 200 rpm. Luego, el cultivo se trató con PBS, colistina, DSF o colistina en combinación con DSF. En los puntos temporales 0, 6, 12 y 24 h, se retiraron 100 µl de cultivo de bacterias y se resuspendieron en PBS, y las diluciones en serie se mancharon en agar LB. Después de la incubación durante la noche a 37 °C, se recogieron los recuentos de colonias.

El efecto del DSF sobre la formación y erradicación de biopelículas cuando se combina con colistina se evaluó según nuestro estudio anterior30. En resumen, se utilizó el método de tinción con violeta cristal para controlar la formación de biopelículas. E. coli B2 mezclada con colistina sola o en combinación con DSF se cultivó en una placa plana de microtitulación de 96 pocillos (Corning) a 37 °C durante 36 h. Luego, las bacterias planctónicas se eliminaron lavando tres veces con solución estéril de PBS y se agregaron 100 µL de metanol y se fijaron durante 15 min. Después de aspirar el fijador y secar al aire natural, los pocillos secos se tiñeron con 100 µl de cristal violeta al 0,1% durante 15 minutos y el cristal violeta restante se enjuagó con PBS dos veces. Finalmente, se agregaron 100 µL de ácido acético al 33% y se cultivaron a 37 °C durante 30 minutos para disolver el cristal violeta. La masa de biopelícula se determinó a una absorbancia de 570 nm utilizando un lector de microplacas (Tecan Infinite E Plex).

El efecto de erradicación de biopelículas se evaluó contando las colonias bacterianas. Las células bacterianas en fase exponencial se diluyeron en 1/1000 con MHB y se cultivaron en una placa de microtitulación de 96 pocillos (Corning) a 37 °C durante 48 h para promover la formación de biopelículas. Después de lavar tres veces con PBS, se añadió colistina sola o una combinación de colistina-DSF y se cultivó a 37 °C. Después de 2 h de incubación, los pocillos se vaciaron, se lavaron y se sonicaron durante 15 minutos para dispersar las células de la biopelícula. A continuación, se colocaron suspensiones diluidas con bacterias en placas de MHA y se incubaron durante la noche a 37 °C. Se contaron las colonias bacterianas y se calcularon las UFC primarias por ml. Finalmente, las UFC restantes se utilizaron para evaluar la eliminación del biofilm.

Los ensayos de purificación de proteínas y de inhibición enzimática se realizaron según estudios previos40,41. Brevemente, el vector de expresión clonado con la secuencia codificante de NDM-1 o NDM-5 se transformó químicamente en E. coli BL21 (DE3). Las proteínas NDM recombinantes se purificaron usando agarosa NTA (ácido nitrilotriacético) y luego se evaluaron mediante análisis SDS-PAGE, y sus concentraciones se midieron usando un kit de ensayo de proteínas BCA mejorado (Beyotime, Shanghai, China). Se incubaron proteínas NDM purificadas (50 nM) en tampón HEPES (50 mM, pH = 7,2) con concentraciones crecientes de DSF durante 5 minutos a 25 °C. El ensayo de inhibición enzimática se realizó en una placa de 96 pocillos a una absorbancia de 492 nm a temperatura ambiente mediante un lector de microplacas (Tecan Infinite E Plex). Se realizaron controles positivos en presencia de NDM y en ausencia de DSF, mientras que los controles negativos se realizaron en ausencia de NDM. La actividad residual de NDM se calculó de la siguiente manera:

(Ecuación 1) Actividad residual (%) = (ODmuestra − ODnegativa) / (ODpositiva – ODnegativa) × 100%

La estructura química de DSF se preparó utilizando el software ChemDraw. Las estructuras cristalinas de la proteína NDM-1 (código PDB, 4EYL) o MCR-1 (código PDB, 5GRR) se obtuvieron del Protein Data Bank (PDB) y DSF se preprocesó con el software Pymol. Posteriormente el acoplamiento se realizó utilizando el software Ledock. Se eligieron los modelos mejor generados para el análisis de interacción. Todas las figuras de los modelos de estructura se generaron utilizando el software Pymol.

E. coli B2 se cultivó durante la noche y se diluyó 1:1000 en el medio nuevo con diferentes concentraciones de DSF. Después de que las células bacterianas crecieron hasta una DO600 de 0,5, se extrajo el ARN total utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Luego, se transcribió de forma inversa un total de 1000 ng de ARN purificado en ADNc utilizando el kit de reactivos PrimeScript RT con gDNA Eraser (Takara, Beijing, China). La siguiente mezcla de reacción de PCR se preparó utilizando los kits ChamQ™ SYBR® Color qPCR Master Mix (Vazyme Biotech, Nanjing, China) y el análisis de RT-qPCR se realizó mediante el sistema de PCR en tiempo real 7500 Fast (Applied Biosystem, CA, EE. UU.) . Los parámetros de amplificación se establecieron de la siguiente manera: desnaturalización inicial a 95 °C durante 30 s, seguida de 40 ciclos a 95 °C durante 5 s, 60 °C durante 30 s y 72 °C durante 45 s. La expresión del ARNr de 16 s sirvió como gen de mantenimiento para analizar los cambios en otros genes utilizando el método 2^-(∆∆Ct). Las secuencias de los cebadores se enumeraron en la Tabla complementaria 6.

El SEM se utilizó para evaluar el efecto del DSF sobre la morfología de la superficie bacteriana42. Brevemente, las células bacterianas se cultivaron hasta la fase exponencial y se preincubaron con colistina sola o una combinación de DSF y colistina a 37 °C. Después de la incubación durante 1 h, las células se lavaron dos veces con PBS y luego se fijaron con glutaraldehído al 2,5% a 4 °C durante la noche. Posteriormente, las muestras fueron deshidratadas en una serie de etanol (30%, 50%, 70%, 90 y 100%) durante 10 min. Las muestras fueron evaluadas con GeminiSEM 300.

La permeabilidad de la membrana externa del tratamiento con E. coli B2 mediante DSF se midió con una sonda fluorescente 1-N-fenilnaftilamina (NPN, 10 μM)43. Las células bacterianas se lavaron con PBS y se ajustaron a 1 x 107 UFC/ml, y luego la suspensión bacteriana se incubó con NPN a 37 °C durante 30 minutos. A continuación, la mezcla se añadió a placas negras de 96 pocillos (Corning, NY, EE. UU.) que contenían la concentración en serie de fármacos. La intensidad de la fluorescencia se determinó con longitudes de onda de excitación y emisión a 350 y 420 nm.

La integridad de la membrana celular de E. coli B2 se midió con yoduro de propidio (PI) 10 nM44. La fluorescencia se evaluó con la longitud de onda de excitación a 535 nm y la longitud de onda de emisión a 615 nm.

El tinte fluorescente yoduro de 3,3'-dipropiltiadicarbocianina (DiSC3(5)) se utilizó para evaluar la despolarización de la membrana citoplasmática de E. coli B2 tratada con DSF45. Las células bacterianas se resuspendieron a una DO600 de 0,5 y luego se añadió DiSC3(5) a una concentración final de 0,5 µM y se incubaron durante 10 minutos. Después de 30 minutos, se inyectó la suspensión bacteriana en una placa de paredes negras y se añadió una concentración final de DSF o concentraciones crecientes de colistina. La intensidad de la fluorescencia se determinó con longitudes de onda de excitación/emisión de 622/670 nm.

El nivel de ROS se probó como se describió anteriormente. Se incubó E. coli B2 en fase logarítmica con diacetato de 2',7'-diclorodihidrofluoresceína (DCFH-DA) (10 μM) durante 30 minutos, las células bacterianas se lavaron tres veces con PBS para asegurar la eliminación del exceso de sondas fluorescentes. A continuación, las células sondadas se trataron con concentraciones variables de colistina y DSF durante 1 h. Después de la incubación, la intensidad de la fluorescencia se midió inmediatamente con longitudes de onda de excitación y emisión a 488 y 525 nm.

Se cultivó E. coli B2 resistente a colistina hasta la fase exponencial y se cultivaron bacterias con colistina sola o en combinación con DSF (n = 3 muestras biológicamente independientes). Después de una incubación durante 4 h, se recogieron las células y se extrajo el ARN total de las bacterias utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen). A continuación, se cuantificó el ARN utilizando un espectrofotómetro Nanodrop (Thermo Scientific, MA, EE. UU.), seguido de la construcción de la biblioteca, la secuenciación y el análisis bioinformático. La biblioteca RNA-seq se construyó utilizando el kit de preparación de ARNm trenzado Illumina® (San Diego, CA). Brevemente, todos los ARNm se dividieron en fragmentos cortos (200 nt) añadiendo tampón de fragmentación. Luego, se sintetizó ADNc bicatenario con cebadores hexámeros aleatorios (Illumina) y se sometió a reparación terminal, fosforilación y adición de adenina de acuerdo con el protocolo de construcción de bibliotecas de Illumina. La biblioteca de secuencias de ARN de extremos emparejados se secuenció con Illumina Novaseq 6000 (Illumina Inc., San Diego, CA, EE. UU.). Posteriormente, los datos generados desde la plataforma Illumina se utilizaron para el siguiente análisis bioinformático. Todos los análisis se realizaron utilizando la plataforma online gratuita de Majorbio Cloud Platform (www.majorbio.com). Se utilizó el paquete DESeq2 para el análisis de expresión diferencial. La anotación funcional se realizó con la base de datos GO y KEGG.

El desarrollo de resistencia de una combinación de colistina y DSF se evaluó utilizando un método descrito previamente46. Brevemente, E. coli C3 con NDM positivo en fase logarítmica o E. coli G92 con MCR positivo se diluyeron en un suplemento de caldo LB con 0,25 × MIC de DSF en presencia o ausencia de colistina (0,25 × MIC) y se cultivaron a 37 °C. durante 24h. Se determinó la MIC de las bacterias. A continuación, este cultivo se diluyó en caldo LB fresco que contenía sub-MIC de fármacos para el siguiente pase. El pase in vitro se repitió de forma continua durante 24 días.

Las bacterias se cultivaron en caldo LB a 37 °C durante la noche para lograr una DO600 de 0,5. Para formar el sistema de conjugación final, se mezclaron 1 ml de bacterias donadoras y receptoras y se cultivaron durante 15 h en presencia de diferentes concentraciones de DSF (0 a 128 μg/ml). Además, se determinaron más a fondo varias cepas clínicas con plásmidos portadores de blaNDM-5 y plásmidos portadores de mcr-1. Los plásmidos portadores de IncX3 blaNDM-5 eran de K. pneumoniae y E. coli, respectivamente. Los dos plásmidos IncI2 e IncX4 con genes de resistencia mcr-1 se derivaron de aislados clínicos de E. coli LD67-1 y LD93-1.

Se estableció un modelo de infección por larvas de Galleria mellonella para evaluar la sinergia entre colistina/meropenem y DSF in vivo. Brevemente, las larvas (Huiyude Biotech, Tianjin, China) se dividieron aleatoriamente en seis grupos experimentales (n = 8 animales biológicamente independientes por grupo) y se infectaron 10 µL de suspensión B2 o C3 de E. coli (106 UFC) en el gasterópodo posterior derecho. . Después de una incubación de 1 h, se administró una dosis única de colistina (5 mg/kg), meropenem (10 mg/kg), DSF (20 mg/kg), colistina más DSF (5 + 10 mg/kg, 5 + 20 mg/ kg), se administró meropenem más DSF (10 + 10 mg/kg, 10 + 20 mg/kg) o PBS. Posteriormente, se registraron las tasas de supervivencia hasta 7 días después de la infección.

Para el análisis de hemólisis, las muestras se procesaron como se describió anteriormente47. Brevemente, se incubó colistina más DSF en volúmenes iguales con un 8% de células sanguíneas de oveja desfibrinadas, estériles y frescas, a 37 °C. Se utilizó PBS como control negativo y ddH2O como control positivo. La actividad hemolítica se midió a una absorbancia de 567 nm mediante un lector de microplacas Infinite E Plex (Tecan) y la tasa de hemólisis se calculó en consecuencia.

Se obtuvieron ratones hembra CD-1 (de 8 semanas de edad; 20 a 25 g) del Centro de Medicina Comparada de la Universidad de Yangzhou. Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices del Comité Administrativo de Animales de Laboratorio de Jiangsu sobre Bienestar de los Animales de Laboratorio y Ética del Comité Administrativo de Animales de Laboratorio de Jiangsu. Los protocolos de uso de animales fueron aprobados por el Comité Administrativo de Animales de Laboratorio de Jiangsu (SYXK-2022-0044). El número de licencia de uso de animales de laboratorio es SCXK-2022-0009, certificado por la Asociación de Ciencia y Tecnología de Jiangsu.

La toxicidad in vivo de la combinación DSF-COL se determinó inyectando por vía intraperitoneal una dosis única de la combinación de fármacos en ratones CD-1 (n = 6 animales biológicamente independientes por grupo). Además de las inyecciones durante 6 días, también se deben registrar continuamente el comportamiento de los animales y el peso corporal. Se extrajo sangre el último día para análisis bioquímicos de sangre y análisis de células de sangre completa.

Brevemente, ratones hembra CD-1 de 8 semanas de edad se volvieron neutropénicos mediante la administración de ciclofosfamida (150 y 100 mg/kg) 4 y 1 día antes de la inyección (n = 6 animales biológicamente independientes por grupo). Posteriormente, se inyectaron 100 μl de suspensión de E. coli B2 en fase exponencial (105 UFC por ratón) en los muslos derechos. A las 2 h post-infección, una dosis única de colistina (5 mg/kg, ip), DSF (2 mg/kg, ip), colistina más DSF (5 + 10 mg/kg, 5 + 20 mg/kg), o se administró PBS. A continuación, los ratones fueron sacrificados después de 48 h después de la infección. Los muslos derechos se recogieron asépticamente, se homogeneizaron, se diluyeron en serie y se sembraron en agar LB. Después de la incubación a 37 °C durante 24 h, se contó el número de bacterias en los tejidos.

Se infectaron por vía intraperitoneal ratones hembra CD-1 (n = 6 animales biológicamente independientes por grupo) con una dosis de 108 UFC de suspensión C3 de E. coli. A las 2 h después de la infección, a los ratones se les administró una dosis única de meropenem (10 mg/kg), DSF (20 mg/kg) solo o una combinación de meropenem con DSF (10 + 10 mg/kg, 10 + 20 mg/kg). kg) mediante inyección intraperitoneal. Se registraron las tasas de supervivencia de los ratones tratados durante 7 días.

El análisis estadístico se realizó con GraphPad Prism versión 9.0. Todos los experimentos se realizaron con al menos tres réplicas biológicas independientes y los datos se expresan como media ± desviación estándar (DE). Se utilizó ANOVA unidireccional/bidireccional para calcular los valores de P (*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001 y ****P <0,0001).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de secuenciación de ARN se han depositado en la base de datos del Archivo de lectura de secuencias (SRA) del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) (PRJNA817728). Los datos de origen de las cifras principales se proporcionan en Datos complementarios 1. Todos los demás datos están disponibles a través de los autores correspondientes.

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Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (2021YFD1801000 y 2018YFA0903400), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32222084, 32172907 y 32002331), el Fondo de Innovación en Ciencia y Tecnología Agrícola de Jiangsu (CX(21)2010), A Proyecto financiado por el Desarrollo del Programa Académico Prioritario de las Instituciones de Educación Superior de Jiangsu (PAPD) y el Proyecto 111 D18007.

Centro de Coinnovación de Jiangsu para la Prevención y el Control de Zoonosis y Enfermedades Infecciosas Animales Importantes, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad de Yangzhou, Yangzhou, 225009, China

Chen Chen, Jinju Cai, Jingru Shi, Zhiqiang Wang y Yuan Liu

Laboratorio Internacional Conjunto de Investigación sobre Agricultura y Seguridad de Productos Agro, Ministerio de Educación de China, Universidad de Yangzhou, Yangzhou, 225009, China

Zhiqiang Wang y Yuan Liu

Instituto de Medicina Comparada, Universidad de Yangzhou, Yangzhou, 225009, China

Yuan Liu

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YL y ZW diseñaron y supervisaron el proyecto. CC realizó experimentos, analizó datos y redactó el manuscrito. JC ayudó a realizar experimentos. JS ayudó a analizar los datos. YL escribió y revisó el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Zhiqiang Wang o Yuan Liu.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Renee Fleeman y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores primarios: César de la Fuente y Tobías Goris.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Chen, C., Cai, J., Shi, J. et al. Resensibilización de bacterias Gram negativas resistentes a múltiples fármacos a carbapenémicos y colistina utilizando disulfiram. Común Biol 6, 810 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05173-7

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Recibido: 13 de marzo de 2023

Aceptado: 24 de julio de 2023

Publicado: 03 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05173-7

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